Muda-se para Paris, em seguida, e vai estudar química e física na Escola Normal Superior. Formado, em 1847, passa a lecionar em escolas de Estrasburgo, Lille e Paris. Em 1867 torna-se professor da Universidade Sorbonne e pesquisa as doenças do bicho-da-seda.
Descobre por meio deles que a putrefação e a fermentação são causadas por microrganismos, o que impulsiona o estudo das doenças contagiosas. Em uma experiência de 1881, realizada com seus colaboradores Chamberland e Roux, demonstra que carneiros e vacas inoculados com o bacilo atenuado da bactéria carbunculosa ficam protegidos contra a doença.
Desenvolve as vacinas anti-rábica e contra a cólera das galinhas em 1885. Em 1888 inaugura em Paris o Instituto Pasteur, dedicado a estudos bioquímicos, no qual trabalha até morrer.