Nascido em Lisboa, assume o trono após a morte do pai, dom Manuel I. Algum tempo depois casa-se com dona Catarina, irmã de Carlos V, imperador do Sacro Império Romano-Germânico e rei da Espanha. Passa a reprimir a pirataria francesa, mas fica neutro nas guerras entre a França e Carlos V.
Apesar de não ser muito culto, protege as ciências e as artes e funda, em Coimbra, o Colégio das Artes. O colégio conta com a presença de importantes humanistas até ser entregue aos jesuítas, depois da adesão do rei à Contra-reforma.
Durante o reinado de João III, agravam-se os problemas econômicos da coroa, com a diminuição do lucro do monopólio no comércio com as Índias. Perde o único filho legítimo ainda jovem. Depois de sua morte, em Lisboa, é sucedido no trono pelo neto Sebastião, na época com 3 anos de idade, sob regência da rainha Catarina.